Первичные тестикулярные клетки PDGFRα+ у человека мультипотентны и могут дифференцироваться в клетки с характеристиками клеток Лейдига in vitro
Интерстициальные стволовые клетки яичка человека, в отличие от грызунов, не имеют полного потенциала к развитию в клетки Лейдига.
Вопрос исследования
Возможно ли дифференцировать первичные клетки яичка человека, положительные на рецептор к тромбоцитарному фактору роста альфа (PDGFRα+), в функциональные клетки Лейдига?
Краткий ответ
Несмотря на то, что тестикулярные PDGFRα+ клетки человека мультипотентны и способны дифференцироваться в стероидогенные клетки с характеристиками клеток Лейдига, они не способны производить тестостерон после дифференцировки.
Что уже известно
У грызунов с помощью маркера PDGFRα были идентифицированы и изолированы стволовые клетки Лейдига (СКЛ), которые могут образовать зрелые тестостерон-продуцирующие клетки Лейдига после должной дифференциации in vitro. Хотя PDGFRα+ клетки также были обнаружены в ткани яичка у людей, пока нет данных в пользу того, что эти клетки являются истинными человеческими СКЛ, способными дифференцироваться в функциональные клетки Лейдига in vitro или in vivo.
Дизайн, объём и продолжительность исследования
Мы изолировали клетки яичка, обогащённые интерстициальными клетками из замороженных и размороженных фрагментов тестикулярной ткани от четырёх людей-доноров. В зависимости от количества полученных клеток, отсортированные PDGFRα+ клетки трёх-четырёх доноров были культивированы in vitro в различных условиях для стимуляции дифференцировки в адипоциты, остеоциты, хондроциты или клетки Лейдига.
Мы сравнили их клеточные характеристики с клетками сразу после сортировки и клетками на этапе культивирования. Чтобы изучить их потенциал дифференцировки in vivo, сортированные PDGFRα+ клетки трансплантировались в яички 12 мышей с выключенным геном рецептора лютеинизирующего гормона (LuRKO), 6 из которых получали иммунодепрессанты. Ещё шесть мышей не подвергались трансплантации клеток и сформировали контрольную группу.
Участники / материалы, условия, методы
Интерстициальные клетки яичка человека культивировались до 3 пассажа и сортировались с помощью FACS по HLA-A,B,C+/CD34−/PDGFRα+. Мы изучали экспрессию мембранных белков мезенхимальных стромальных клеток (МСК) с помощью FACS. Кроме того, мы изучали специфическое по происхождению окрашивание и экспрессию генов после дифференцировки МСК по всем трём ветвям.
Что касается дифференцировки до клеток Лейдига, сортированные PDGFRα+ клетки культивировались в среде для пролиферации или дифференциации в течение 28 дней, после чего они стимулировались на протяжении 24 часов с помощью ХГЧ, форсколина или dbcAMP для того чтобы изучить повышение экспрессии стероидогенных ферментов с помощью количественной ПЦР.
Кроме того, в среде культивации измерялся уровень тестостерона, андростенедиона и прогестерона. Мы также трансплантировали человеческие интерстициальные клетки яичка сортированные по PDGFRα+ в яички мышей LuRKO. В несколько временных точек после трансплантации проводился сбор сыворотки и определение уровня тестостерона. Через двадцать недель после трансплантации яички удалялись для гистологического исследования.
Основные результаты и влияние случайности
Из первичных культивированных тестикулярных интерстициальных клеток человека на 3 пассаже мы смогли получить популяцию клеток HLA-A,B,C+/CD34−/PDGFRα+ с помощью FACS. Сортированные клетки демонстрировали характеристики МСК и могли дифференцироваться в адипоциты, хондроциты и остеоциты. После направленной дифференциации до клеток Лейдига in vitro мы наблюдали значительное повышение экспрессии HSD3B2 и INSL3.
После 24 часов стимуляции форсколином или dbcAMP наблюдалось значительное усиление экспрессии STAR и CYP11A1. Клетки уже экспрессировали HSD17B3 и CYP17A1 перед дифференцировкой, но экспрессия этих генов не повышалась значимым обрахом поосле дифференцировки и стимуляции. Уровень тестостерона невозможно было определить в среде ни при каких условиях стимуляции, но после стимуляции форсколином и dbcAMP в среде можно было обнаружить андростенедион и прогестерон.
После трансплантации человеческих клеток в яички мышей LuRKO не наблюдалось значительного повышения уровня тестостерона в сыворотке по сравнению с контрольной группой. Кроме того, через 20 недель после трансплантации в интерстиции яичек мышей человеческих клеток не обнаруживалось.
Ограничения и причины для осторожности
Это исследование выполнялось с использованием ткани только от четырёх доноров из-за ограничений в донорском материале. Из-за необходимости получить достаточное число клеток мы в первую очередь культивировали клетки до 3 пассажа перед тем как выполнить FACS для получения нужной клеточной популяции. Нельзя исключить, что культивирование привело к потере клетками свойств стволовых клеток.
Более широкие выводы из полученных результатов
Большая доля информации о развитии клеток Лейдига была получена из исследований на грызунах, тогда как объём знаний о развитии клеток Лейдига у людей очень ограничен. Наше исследование демонстрирует, что тестикулярные интерстициальные PDGFRα+ клетки человека имеют другие характеристики по сравнению с тестикулярными PDGFRα+ клетками грызунов, отличаясь по уровню экспрессии стероидогенных ферментов и потенциалу дифференцировки в зрелые клетки Лейдига в сопоставимых культуральных условиях.
Это подчёркивает необходимость подтверждения результатов исследований на грызунах у людей, чтобы это позволяло транслировать данные на человека и в конце концов внести вклад в усовершенствование тестостерон-заместительной терапии или развитие альтернативной клеточной терапии в будущем, потенциально основанной на СКЛ.
Финансирование исследования / конфликт интересов
Это исследование финансировалось Amsterdam UMC, AMC, Амстердам, Нидерланды. У авторов нет конфликта интересов.
J Eliveld, E A van den Berg, J V Chikhovskaya, S K M van Daalen, C M de Winter-Korver, F van der Veen, S Repping, K Teerds, A M M van Pelt
Human Reproduction, Volume 34, Issue 9, September 2019, Pages 1621–1631
DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/dez131