Изучение активина A в воспалительном ответе яичка и его роль в развитии тестикулярного фиброза
Активин A является одним из факторов, способствующих развитию фиброза яичка при различных патологических состояниях.
Вопрос исследования
Вносит ли активин A свой вклад в тестикулярный фиброз в условиях воспаления?
Краткий ответ
Наши результаты демонстрируют, что активин A и ключевые фибротические белки имеют повышенную экспрессию в тестикулярных биоптатах человека с лейкоцитарными инфильтратами и нарушенным сперматогенезом, а также при экспериментальном аутоиммунном орхите (ЭАО) у мышей; активин A стимулирует фиброзный ответ в перитубулярных клетках (ПТК) и фибробластах NIH 3T3.
Что уже известно
Фиброз является характеристикой ЭАО. Активин A, регулятор фиброза, имеет повышенную экспрессию в яичках мышей с ЭАО, а его экспрессия коррелирует с тяжестью заболевания.
Дизайн, объём и продолжительность исследования
Это поперечное и продольное исследование, в котором взрослых мышей иммунизировали с использованием тестикулярного гомогената (ТГ) с адъювантом для индукции ЭАО, через 30 (n = 6), 50 (n = 6) и 80 (n = 5) дней после которой производили сбор биологического материала. В качестве контрольной группы включали мышей сопоставимого возраста, получавших только адъювант (n = 14), и мышей, которым не вводили ничего (n = 15).
ТГ-иммунизированные мыши с повышенным уровнем эндогенного фоллистатина получали инъекцию нерепликативного рекомбинантного адено-ассоциированного вирусного вектора, несущего кассету гена фоллистатина (rAAV-FST315; n = 3), или вектора с пустой кассетой (контроль с пустым вектором; n = 2) за 30 дней до первой иммунизации, а также оценивались контроли, которым вводился адъювант (n = 2) или не вводилось ничего (n = 2).
Включались тестикулярные биоптаты человека с местными воспалительными изменениями, ассоциированными с нарушенным сперматогенезом (n = 7). Биоптаты с интактным сперматогенезом без воспаления, взятые у пациентов с обструктивной азооспермией, служили контрольными образцами (n = 7).
Первичные мышиные фибробласты PTC и NIH 3T3 были стимулированы активином A и фоллистатином 288 (FST288) для изучения влияния активина A на экспрессию фибротических маркеров. Изучалась также продукция активина A первичными клетками Сертоли (КС) мышей.
Участники / материалы, условия, методы
Тестикулярная РНК и экстракты белка были получены у мышей в дни 30, 50 и 80 после первой иммунизации и использованы для анализа маркерных генов и белков фиброза соответственно. Общее содержание коллагена оценивалось с помощью гидроксипролинового теста и по фибронектину; экспрессия коллагена I, III и IV, α-гладкомышечного актина (α-SMA) и фосфорилирование «suppressor of mothers against decapentaplegic» (SMAD) 2 измерялись с помощью вестерн-блоттинга.
Для обнаружения фибронектина использовалась иммунофлуоресценция. Содержание мРНК фибронектина (Fn), αSMA (Acta2), коллагена I (Col1a2), III (Col3a1) и IV (Col4a1) в ПТК и клетках NIH 3T3, обработанных активином A и / или FST288, измерялось с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Активин A в СК после стимуляции фактором некроза опухоли (TNF) или FST288 определялся с помощью ELISA. Тестикулярные биоптаты человека анализировались с помощью qRT-PCR на предмет PTPRC (CD45) и активина A (INHBA), проводился гидроксипролиновый тест и иммунофлуоресцентный анализ.
Основные результаты и влияние случайности
Продукция активина A клетками Сертоли была стимулирована 25 и 50 нг/мл TNF (P < 0.01, P < 0.001, соответственно) по сравнению с необработанными клетками. В тестикулярных биоптатах человека с лейкоцитарными инфильтратами и нарушенным сперматогенезом повышалось содержание мРНК INHBA по сравнению с контрольными биоптатами (P < 0.05), что сопровождалось повышенным отложением общего коллагена (P < 0.01) и фибронектина.
Экспрессия общего тестикулярного коллагена (P < 0.0001) и белка фибронектина (P < 0.05) также были повышены при ЭАО, а экспрессия фибронектина коррелировала с тяжестью заболевания (r = 0.9028). У животных, получавших rAAV-FST315 перед иммунизацией с помощью ТГ, экспрессия белка фибронектина была сопоставима с контрольной группой. Стимуляция ПТК и клеток NIH 3T3 с помощью ингибина A повышала уровень мРНК фибронектина (P < 0.05) и продукцию коллагена I (P < 0.001; P < 0.01) и фибронектина (P < 0.05).
Более того, активин A также повышал содержание мРНК коллагена IV (P < 0.05) в ПТК, а содержание мРНК αSMA (P < 0.01) и белка αSMA (P < 0.0001) значительно повышалось при воздействии активина A на клетки NIH 3T3.
Ограничения и причины для осторожности
Для исследования было доступно лишь ограниченное количество образцов тестикулярной ткани человека. Часть исследования выполнялась in vitro, включая клетки NIH 3T3 в качестве суррогата человеческих фибробластов.
Более широкие выводы из полученных результатов
Местные фибробласты и ПТК могут вносить вклад в прогрессирование тестикулярного фиброза после воспаления, а активин A является ключевым медиатором этого процесса.
Финансирование исследования / конфликт интересов
Эта работа была поддержана National Health and Medical Research Council of Australia, Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program и International Research Training Group с участием Justus Liebig University (Giessen) и Monash University (Melbourne) (GRK 1871/1–2) по теме `Molecular pathogenesis on male reproductive disorders’, финансируемой Deutsche Forschungsgemeinschaft и Monash University. У авторов нет конфликтов финансовых интересов.
A Christine Kauerhof, Nour Nicolas, Sudhanshu Bhushan, Eva Wahle, Kate A Loveland, Daniela Fietz, Martin Bergmann, Nigel P Groome, Sabine Kliesch, Hans-Christian Schuppe, Adrian Pilatz, Andreas Meinhardt, Mark P Hedger, Monika Fijak
Human Reproduction, Volume 34, Issue 8, August 2019, Pages 1536–1550
DOI: https://doi.org/10.1093/humrep/dez109