Цель исследования
Изучить способность сперматогониальных стволовых клеток человека (ССКЧ) пролиферировать in vitro в условиях для культуры сперматогониальных стволовых клеток мыши (ССКМ).
Дизайн исследования
Экспериментальное фундаментальное научное исследование.
Условия выполнения исследования
Лаборатория репродуктивной биологии.
Пациент(ы)
Криопресервированная ткань яичек с нормальным сперматогенезом, полученная у трёх доноров, которым была выполнена орхиэктомия как метод лечения рака предстательной железы.
Проведённые вмешательства
Клетки яичек были использованы для создания клеточных культур in vitro, которые соответствовали следующим группам: [1] несортированные клетки яичек человека, [2] раздельно культивированные клетки яичек человека и [3] клетки, обогащённые белками главного комплекса гистосовместимости 1 класса (HLA−) / поверхностным антигеном эпителиальных клеток (EPCAM+), в одной культуре с инактивированными сустеноцитами того же пациента.
Основные оцениваемые результаты
Анализ и характеризация, включающие в себя иммуногистохимическое исследование и количественную обратно-транскрипционную полимеразную цепную реакцию на соматические и герминальные маркеры, количественное определение уровня тестостерона и ингибина B, исследование TUNEL.
Результат(ы)
Предполагаемые ССКЧ встречались единично, дуплетами или небольшими группами до четырёх клеток in vitro только когда клетки яичка культивировались в среде StemPro-34 с добавкой нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), лейкемического ингибиторного фактора (LIF), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EDF). Сортировка клеток с активированной флюоресценцией по HLA−/EPCAM+ привела к обогащению ССКЧ VASA+/UTF1+ до 27% по сравнению с 13% в несортированном контрольном материале. Совместное культивирование сортированных клеток с инактивированными сустеноцитами яичка привело к средней плотности ССКЧ 112 на 1 см2 через 2 недели in vitro по сравнению с меньшей плотностью несортированных клеток (61 ССКЧ на 1 см2 ) и раздельно культивированных клеток (49 ССКЧ на 1 см2 ). Однако, предполагаемые ССКЧ редко окрашивались положительно на маркер пролиферации Ki67 и через 4 недели in vitro их количество уменьшалось почти вплоть до полного отсутствия.
Заключение
Мы обнаружили, что ССКЧ демонстрируют ограниченную пролиферацию in vitro в условиях для культивирования ССКМ. Совместное культивирование сортированных по HLA−/EPCAM+ клеток с сустеноцитами яичка улучшило соотношение герминальных и соматических клеток.