Двухнитевые разрывы ДНК, ее восстановление в незрелых яйцеклетках человека и значимость этих процессов для возобновления мейотического деления.

Цель
Толь­ко 50–60% не­зре­лых яй­це­кле­ток че­ло­ве­ка до­сти­га­ют зре­ло­сти in vitro. Та­кой де­фи­цит мо­жет от­ра­жать не­опти­маль­ные усло­вия со­зре­ва­ния in vitro (IVM) или быть про­яв­ле­ни­ем врож­ден­ных де­фек­тов яй­це­клет­ки. В дан­ном ис­сле­до­ва­нии мы про­ве­ри­ли ги­по­те­зу о том, что ДНК не­зре­лой яй­це­клет­ки мо­жет быть по­вре­жде­на и что та­кое со­сто­я­ние ДНК или не­воз­мож­ность ее вос­ста­нов­ле­ния свя­за­на с оста­нов­кой раз­ви­тия за­ро­ды­ше­во­го пу­зырь­ка (ЗП).
Ме­то­ды
Не­зре­лые яй­це­клет­ки (на ста­дии ЗП) бы­ли по­лу­че­ны у жен­щин, про­хо­дя­щих цик­лы ЭКО со сти­му­ля­ци­ей ову­ля­ции (Stim-C) или со­зре­ва­ни­ем in vitro (IVM-C). Яй­це­клет­ки на ста­дии ЗП, по­лу­чен­ные в цик­лах со сти­му­ля­ци­ей, фик­си­ро­ва­ли для по­сле­ду­ю­ще­го ана­ли­за сра­зу по­сле из­вле­че­ния (T0) или по­сле ин­ку­ба­ции в те­че­ние 30 ч (Т30), ес­ли их раз­ви­тие оста­нав­ли­ва­лось на ста­дии ЗП. Яй­це­клет­ки, из­вле­чен­ные в цик­лах с IVM, ис­поль­зо­ва­ли толь­ко в том слу­чае, ес­ли по­сле 30 ч ин­ку­ба­ции они все еще на­хо­ди­лись на ста­дии ЗП. Все яй­це­клет­ки фик­си­ро­ва­ли и окра­ши­ва­ли для изу­че­ния хро­ма­ти­на и ак­ти­на. Так­же про­ве­ли ана­лиз на γH2AX и Rad51, мар­ке­ры двух­ни­те­вых раз­ры­вов ДНК и ак­ти­ва­ции вос­ста­нов­ле­ния ДНК, со­от­вет­ствен­но. Ме­че­ные яй­це­клет­ки про­ана­ли­зи­ро­ва­ли с по­мо­щью ла­зер­но­го ска­ни­ру­ю­ще­го кон­фо­каль­но­го мик­ро­ско­па Leica TCS SP2.
Ре­зуль­та­ты
В груп­па Т0 и Т30 из цик­лов Stim-C 47,5% и 81,5% яй­це­кле­ток со­от­вет­ствен­но со­дер­жа­ли γH2AX (P = 0,003), в то вре­мя как в груп­пе IVM-C T30 58,3% яй­це­кле­ток бы­ли по­ло­жи­тель­ны на γH2AX (Stim-C T0 про­тив IVM-C T30, P = 0,178; Stim-C T30 про­тив IVM-C T30, P = 0,035). По­ло­жи­тель­ное окра­ши­ва­ние яд­ра на Rad51 от­ме­че­но у 42,1% и 74,1 % яй­це­кле­ток из T0 и T30 под­групп Stim-C, со­от­вет­ствен­но (Р= 0,006), в то вре­мя как в груп­пе IVM-C T30 у 66,7% яй­це­кле­ток при­сут­ство­вал мар­кер вос­ста­нов­ле­ния ДНК (Stim-C T0 про­тив IVM-C T30, P = 0,010; Stim-C T30 про­тив IVM-C T30, P = 0,345).

Вы­во­ды
По­лу­чен­ные дан­ные под­твер­жда­ют на­ли­чие двух­ни­те­вых раз­ры­вов ДНК в не­зре­лых яй­це­клет­ках че­ло­ве­ка. Так­же они со­гла­су­ют­ся с ги­по­те­зой о том, что на­ру­ше­ние це­лост­но­сти ДНК мо­жет иметь боль­шое зна­че­ние для воз­об­нов­ле­ния мей­о­за.